Preanalytika-molekulární biologie

Podrobnější informace o preanalytických podmínkách pro molekulárně biologická vyšetření jsou uvedeny u jednotlivých metod úseku molekulární biologie.

Humánní genom

Analýza deoxyribonukleové kyseliny (DNA) a ribonukleové kyseliny (RNA).

Metoda

Veškerá vyšetření vycházejí z izolované DNA nebo RNA a polymerázové řetězové reakce (PCR). Způsob detekce se pří různých vyšetřeních může lišit. Při identifikaci přítomnosti chromosomové přestavby je hodnocena přítomnost proužku na elektroforetickém gelu (potvrzení přítomnosti přestavby t(9;22) bcr major nebo minor. Při zjišťování bodových mutací v konkrétních genech používáme a) analýzu restrikčních fragmentů (genotypizace apolipoproteinu E, defekt v genu pro alfa-1-antitrypsin, mutace H63D a C282Y v HFE genu); b) analýzu teploty tání (mutace G1691A Leiden v genu pro faktor V, G20210A v genu pro faktor II, C677T v genu pro MTHFR); c) metodu reverzní hybridizace (36 mutací v genu CFTR). U kvantitativních analýz se provádí analýza jak vyšetřovaného, tak housekeepingového genu pomocí real-time PCR a výsledek získaný na podkladě kalibrační křivky se následně normalizuje vůči expresi housekeepnigového genu (kvantifikace BCR-ABL).

Materiál

Venózní nesrážlívá krev - fialová zkumavka s EDTA (2 - 5 ml; pro BCR-ABL analýzu se používá 6 - 10 ml EDTA krve s přídavkem ACD), vzorek kostní dřeně ze sternální punkce ve stejném typu zkumavky (0,2 - 1 ml). Alternativně bukální stěr, ostříhané nehty nebo tkáň v parafinovém bločku.
Transport a stabilita - stabilita DNA do 72 hodin, pro analýzu DNA je možno materiál zamrazit, transportovat či uchovávat v chladnici nebo při pokojové teplotě. Stabilita RNA (u BCR-ABL) je několik hodin. Maximálně přípustná doba transportu pro analýzu RNA se udává 24 hodin. Materiál pro RNA analýzu se nesmí transportovat ani uchovávat zamražený!
Forma výsledku - Komentovaný výsledek či u kvantitativních RNA analýz číselná hodnota normalizovaná vůči housekeepingovému genu (výsledek je udáván v procentech).
Doba odezvy - standardně 2 - 3 týdny, u urgentních případů (uvedením na žádance nebo po telefonické domluvě) 2 - 4 dny podle typu analýzy.

Extrahumánní genom

Příjem vzorků

Vzorky pro molekulárně biologická vyšetření – extrahumánní genom jsou přijímány 24 hodin denně na příjmu materiálu ÚKBD (2. poschodí budova FN č. 22). Výjimku tvoří pouze vzorky pro vyšetření DNA Mycobacterium TBC a DNA atypických mykobakterií, které je nutné zaslat na příjem materiálu ÚKM. Zde je provedena předúprava vzorků (solubilizace materiálu) a následně jsou materiály předány k vyšetření na ÚKBD.
Pro vyšetření požadujeme vždy samostatné vzorky odebrané asepticky, tzn. analýzy není možné provádět ze vzorků určených i pro jiná vyšetření.

Preanalytická fáze

• Správný odběr musí být proveden asepticky (za sterilních podmínek) z důvodu možnosti kontaminace biologického materiálu. Vzorek musí být vždy opatřen žádankou pro molekulárně biologická vyšetření (MB) nebo průvodním listem. Materiál a žádanka musí být jednoznačně čitelně identifikovány (rodné číslo, jméno, příjmení, diagnóza, adresa žadatele včetně IČP, telefon a požadovaná vyšetření) dle všeobecných pokynů, vhodné je i vyplnění doplňujících informací na druhé straně MB žádanky, viz kapitola C 07 a D 01.
• Podrobnější informace (odběr, transport, preanalytická fáze atd.) týkající se vyšetření jednotlivých patogenů jsou uvedeny na webu ukbd.fnhk.cz.
• Při označení vzorku a žádanky STATIM je vyšetření provedeno v co nejkratším možném čase. U těchto vzorků je ale nezbytná předchozí telefonická konzultace s VŠ pracovníkem úseku (PharmDr. Plíšková, Mgr. Kutová ) 
• V případě jakýchkoliv nejasností vždy kontaktujte úsek molekulární biologie na telefonu 495 833 866 nebo 495 833 894.

Obecné pokyny pro odběr biologického materiálu k molekulárně biologickému vyšetření extrahumánního genomu:

• krev
  • nesrážlivá (odběr do EDTA, fialová zkumavka) 2 – 5 ml
  • srážlivá (červená zkumavka) 2 – 5 ml nebo 0,5 ml odděleného séra
• moč - 5 – 10 ml do sterilní zkumavky
• likvor - 0,2 – 1,5 ml do sterilní zkumavky
• sputum, BAL a jiné vzorky z dýchacích cest - 2 – 5 ml do sterilní zkumavky
• stěr, výtěr - suchý sterilní tampón, sterilní výtěrovka, vždy BEZ MÉDIA, transportovat ve sterilní zkumavce
• stěry z děložního čípku, uretry (pro Chlamydia trachomatis a HPV) odebrat pomocí sterilního kartáčku a uchovat v transportním médiu – na vyžádání dodáno laboratoří, z odebraného materiálu je možné provést i nátěr na sklíčko (podobně jako cytologické vyšetření)
• tkáň, bioptický vzorek – odebraný vzorek vložit do sterilní zkumavky na sucho či do minimálního množství sterilní vody, nepoužívat formaldehyd! (není možné provést PCR z důvodu inhibice polymerázy), okamžitě dodat do laboratoře nebo zamrazit při teplotě -70°C, event. -20°C.
• plodová voda - 2-10 ml ve sterilní zkumavce či odběrové stříkačce, prosíme bez jehly
• prafínový bloček - nutno dodat 3-5 tenkých řezů ve sterilní zkumavce, vyšetření není možné provést z celého bločku

Odběry jiných materiálů je možné konzultovat s úsekem molekulární biologie ÚKBD (495 833 866)